Pengembangan Metode Diagnosa Molekuler Berbasis Multiplex RT-PCR : Diagnosa Banding 3 Virus Penyebab Penyakit Avian Influenza, Newcastle Disease dan Gumboro

Penyakit Avian Influenza (AI), Newcastle Disease (ND) dan Gumboro atau Infectious Bursal Disease (IBD) merupakan 3 jenis penyakit infeksious pada unggas yang disebabkan virus RNA. Ketiga penyakit ini merupakan penyakit strategis serta ekonomis di dunia peternakan unggas di Indonesia. Angka mortalitas pada unggas yang terserang penyakit tersebut sangat tinggi bahkan mencapai 100%. Diagnosa agen etiologi ketiga penyakit ini umumnya masih dilakukan secara konvensional dengan cara mengisolasi virus, yang dilanjutkan dengan proses karakterisasi. Pada saat ini diagnosis virus AI, ND dan Gumboro dilakukan secara serologis, dengan menggunakan uji Agar Gel Immmunodiffusion (AGID), uji Haemagglutination (HA), uji Haemagglutinantion Inhibition (HI) dan ELISA. Namun metode-metode diagnosis tersebut mempunyai spesifisitas yang rendah dan kurang dapat mengidentifikasi virus lebih detail. Metode diagnosa cepat yang sekaligus dapat untuk melakukan diagnosa diferensial yang tepat terhadap agen infeksi lain yang mungkin menginfeksi unggas, cenderung memerlukan biaya mahal terutama untuk mendiagnosis pada jumlah sampel yang banyak. Diagnosis penyakit Al, ND dan Gumboro yang dilakukan secara konvensional dengan menggunakan sel kultur dan uji serologis membutuhkan waktu setidaknya 2 minggu untuk menginterpretasi hasil uji. Metode diagnosis cepat menggunakan kit diagnostik yang sudah tersedia di pasaran, meskipun memberikan hasil yang cepat namun belum dapat memberikan hasil yang spesifik untuk penentuan diagnosis diferensial dengan virus lain yang mungkin menginfeksi seekor unggas. Diagnosa molekuler dengan mengamplifikasi gen Matriks (M) virus Al, gen Fusion Protein (F) virus ND dan gen VP2 virus Gumboro yang berbasis multiplex RT-PCR akan memberikan hasil yang lebih cepat, tepat, akurat. Pada penelitian ini, kami mencoba mengembangkan metode untuk diagnosa differensial penyakit Al, ND dan Gumboro yang berbasis single step multiplex RT-PCR, yang lebih efisien untuk diterapkan pada sampel lapangan di wilayah endemis ketiga penyakit tersebut di Indonesia. Selanjutnya, metode diagnosis ini diharapkan tidak hanya dapat digunakan untuk mendiagnosis agen etiologi penyakit Al, ND Gumboro saja namun sekaligus dapat digunakan untuk menentukan diagnosa diferensial agen penyebab penyakit viral pada unggas.
Hasil penelitian menunjukan bahwa diagnosis differensial/banding untuk virus penyebab penyakit AI, ND dan IBD (Gumboro) pada unggas bisa dilakukan dengan teknik multiplex RT-PCR yang secara simultan mengamplifikasi gen M pada virus Al dengan amplikon sebesar 200 bp, gen F virus ND dengan amplikon sebesar 532 dan gen VP-2 virus IBD dengan amplikon sebesar 447 bp dengan kondisi RT-PCR sebagai berikut: reaksi Reverse Transcriptase pada suhu 48°C selama 30 menit, Initial Denaturasi pada suhu 95°C selama 3 menit, Denaturasi pada suhu 95°C selama 20 detik, Annealing pada suhu 50°C selama 30 detik, Ekstensi pada suhu 70°C selama 20 detik dan Final Ekstensi pada suhu 70°C selama 5 menit. Kondisi optimum untuk diagnosis differensial/banding virus penyebab penyakit AI, ND dan IBD tersebut hendaknya diaplikasikan untuk sampel sampel di lapangan dalam jumlah yang besar dengan pelaksanaan yang lebih efektif dan efisien dengan waktu yang lebih cepat dan biaya yang lebih murah.